آزمایشگاه میکروبیولوژی آب
آزمایشگاه میکروبیولوژی آب و فاضلاب:
در آزمایشگاه میکروبیولوژی معتمد محیط زیست شرکت آبرام تمامی آزمایش های میکروبیولوژی آب ،خاک و پساب که در جدول زیر به همراه رو ش های آن ذکر گردیده ، قابل انجام است. آزمایشگاه میکروبیولوژی آب یکی از آزمایشگاه های شرکت آبرام می باشد که مستقر در دانشگاه شهید بهشتی می باشد. تمامی روش های آزمایش ها در جدول زیر ذکر شده است.
| ردیف | آزمایشگاه میکروبیولوژی آب | روش انجام آزمایش | ||
| عنوان آزمایش | واحد | |||
| ۱ | کلی فرم گوارشی | Fecal Coliforms | MPN/100cc | Multiple Tube Technique |
| ۲ | کل کلیفرم | Total Coliforms | MPN/100cc | Multiple Tube Technique |
| ۳ | جستجو و شمارش سودوموناس | Pseudomonas Bacteria | ——– | Multiple Tube Technique |
| ۴ | جستجو و شمارش استروپتوکوک مدفوعی | Fecal Streptococcus | MPN/100ml | Multiple Tube Technique |
| ۵ | باکتری هترورتروف | Heterotroph | CFU/ml | Pour Plate Method |
| ۶ | شمارش باکتری استافیلو کوکوس | – | /100ml | Multiple Tube Technique |
| ۷ | شمارش پارامتر های بیولوژیک(دیاتومه، کلروفیسه، سیانوفیسه،پروتوزوا، روتیفر، کرستاسه، نماتد و سایر موجودات زنده) | – | – | – |
| ۸ | باکتری های احیا کننده گوگرد SRB | Sulfate reducing bacteria | MPN/100ml | – |
مرجع استاندارد های آزمایشگاه میکروی شناسیس آبرام Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater و EPA و ASTM و سازمان ملی استاندارد و سازمان حفاظت محیط زیست ایران می باشد.
کشت میکرو ارگانیسم ها
برای مطالعه میکرو ارگانیسم ها باید آن ها را از لحاظ میکروبی مورد بررسی قرار داد. لذا ، باکتری ها را در معرض محیط کشت خاص قرار داده تا باکتری های خاص آن رشد کنند. برای کشت میکروب ها، هنگامی بهترین نتیجه حاصل می شود که محیط کشت ، مواد مورد نیاز آنها را تامین کند. شرایط محیطی لازم نیز مهیا شده باشد. به این منظور ،محیط کشت باید دارای ویژگی های زیر باشد:
- حاوی انواع و مقادیر کافی مواد غذایی برای ترمیم ساختمان سلول و تامین انرژی باشد.
- محیط کشت،مناسب باکتری باشد.
- PH استریلیزاسیون محیط و نگه داری آن به طور استریل ، بدون از دست رفتن ارزش غذایی آن صورت گیرد.
امروزه محیط های کشت ،به صورت خشک و پودری موجود است و برای ساختن آنها باید طبق دستور عمل نمود. درصورت اختیار داشتن محیط های مذکور به صورت آماده، هرگز نباید محیط کشت را از ترکیبات اولیه تهیه کرد. محیط های کشت حاوی مواد هستند که برای رشد و تکثیر میکروارگانیسم ها لازمند. این محیط ها به دو نوع تقسیم می شوند:
- محیط های کشت طبیعی : از منابع حیوانی یا گیاهی تهیه می شوند، مثل محیط کشت حاوی سیب زمینی ،عصاره گوجه فرنگی،محیط جگر و محیط هایی که در ترکیب آنها از عصاره گوشت استفاده شده است.
- محیط های کشت مصنوعی : ترکیبی از موادشیمیایی با مقادیر معینی از هر کدام هستند. محیط های کشت، از نظر حالت به سه دسته تقسیم می شوند:
- محیط های کشت مایع که به آن ها پسوند برات می افزایند مانند نوترینت برات.
- محیط های کشت نیمه جامد که پسوند مدیوم به آن ها افزوده می شود، مانند SIM مدیوم که درصد آگار آنها کم است.
- محیط های کشت جامد که دارای پسوند آگار هستند،مانند نوترینیت آگار.
روش آزمایش های میکروبی آب
باکتری های معروف که در سطح وسیعی به کار می روند،باکتری های کلی فرم هستند. باکتری های گروه کلیفرم که همه آن ها هوازی و بی هوازی اختیاری ،گرم منفی،فاقداسپور و میله ای شکل می باشند در دمای 35C⁰ به مدت 24تا48 ساعت لاکتوز را تخمیر کرده،گاز تولید می کند.
روش تخمیر چند لوله ای برای باکتری های کلی فرم
در این بحث بااستفاده از روش های استاندارد ایالات متحده،باکتری های کلی فرم شناسایی می شوند. این روش سه مرحله آزمایش پی در پی را در بر می گیرد:
- آزمایش احتمالی
روشی است برای غنی سازی باکتری های کلی فرم که به میزان کمی انتخابی می باشد و به گونه ای طراحی شده که ضعیف ترین سلول کلی فرم نیز قادر به رشد باشد. این آزمایش، در محیط کشت لاکتوز که دارای لوله دورهام است انجام می شود. در این محیط ، قند لاکتوز وجود دارد و عامل انتخابی برای باکتری های کلی فرم می باشد، چون این قند ، توسط این باکتری ها و چند باکتری محدود دیگر تخمیر می شود.
در این روش ، باید 9 لوله مکانکی برات ( هر یک دارای 10mlمحیط کشت) آماده شود. هر ۹ لوله به ترتیب 10ml ، 1ml ، 0.1ml از آب مورد آزمایش و در شرایط استریل تلقیح می شود. 3 لوله ای که با 10ml آب آلوده تلقیح می شود باید دو برابر غلظت محیط کشت داشته باشد. سپس در داخل انکوباتور 35C⁰ به مدت 24تا48 ساعت گذاشته می شود. پس از این وجود گاز در لوله دورهام همراه با کدورت محیط کشت بررسی می شود.
کدورت محیط و وجود گاز نشان دهنده واکنش مثبت احتمالی است. وجود باکتری های کلی فرم و احتمال آلودگی مدفوعی است. کدورت تنها و بدون تشکیل گاز،به عنوان واکنش مثبت ارزیابی نمی شود،زیرا در این صورت باکتری هایی رشد نموده اند که قادر به تولید گاز نبوده و کلی فرم نمی باشند.
- آزمایش تاییدی
این آزمایش در لوله های حاوی لوله دورهام پس از واکنش مثبت آزمایش احتمالی انجام می شود.که درآن باکتری های رشد یافته در لوله های مکانکی، در محیط دیگری به نام BGLB که انتخابی تر از مکانکی است کشت داده می شوند. رنگ و اگزال موجود در BGLB از رشد باکتری های غیر کلی فرم ممانعت می کند. از هر لوله محیط کشت مکانکی مثبت یک لوپ وارد لوله های BGLB و سپس محیط کشت EC(ویژه کلی فرم های مدفوعی) می شود.
لوله های BGLBدر دمای 35C⁰ به مدت48 ساعت در انکوباتور قرار داده می شوند. وجود گازدر لوله دورهام،واکنش مثبت تاییدی را نشان می دهد. لوله های EC را به مدت 24ساعت در دمای44.5درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری می کنیم،تنها کلی فرم ها با منشاء مدفوعی ، در این دما قادر به رشد می باشند. عدم تولید گاز در لوله دورهام گویای واکنش منفی است.
از روی جدولMost probable Number،تعدادکلی فرم ها در 100ml نمونه به دست می آید.
- آزمایش تکمیلی
هدف از انجام این آزمایش ، جدایی میکروارگانیسم های غالب در آزمایش تاییدی است. در آن وجود کلی فرم ها به اثبات می رسد. در این آزمایش از محیط انتخابی Endo یاEMB آگار که حاوی قند لاکتوز استفاده می شود. از محیط BGLB با واکنش مثبت روی EMB کشت خطی داده، و به مدت 24ساعت در دمای 35 درجه سانتی گراد قرار داده می شود.
بعد از انکوباسیون کلنی های تیپیک (قرمزتیره،هسته دار با جلای فلزی یا بدون آن) ،آتیپیک(صورتی مات،بدون هسته و موکوئیدی ) قابل مشاهده می باشد.چنانچه کلنی هایی غیر از این دو نوع ظاهر شوند، نتیجه آزمایش منفی است.در صورت وجود کلنی های تیپیک،یک کلنی ایزوله را باید به لوله حاوی لاکتوز برات و نیز،به لوله کشت پپتون اگار یا نوترینت آگار اسلنت تلقیح کرده، و در حرارت 35درجه سانتی گراد قرار داد. بعد از 24تا48ساعت،در صورت وجود گاز در لاکتوز برات و بررسی میکروسکوپی از پپتون آگار و وجود باکتری های میله ای شکل گرم منفی و بدون اسپور،آزمایش تکمیلی مثبت ارزیابی می شود.
شمارش باکتر ی های هتروتروفیک
باکتری های هتروتروف بـاکتری هـایـی هستند کـه منبع کـربـن آنها منحصراً از کربن آلی تامین شده است. بـاکتری ها ی هتروتروف شامل باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری می باشند. در این گروه باکتری های غیر بیماری زا و فرصت طلب مانند: سودوموناس. و بیماری زا مانند :اشرشیا و آئـرومونـاس وجـود دارنـد و اغـلـب آنها گـرم منفی می باشند. این باکتری هـا شاخص سلامت میکروبی آب نیستند؛ بـرخـی از آنها بیماری زا مانند اشرشیا، و بـرخـی دیگر فرصت طلب می باشند. بـه همین دلیل ایـن باکتری ها در آب باعث به خطر افتادن سلامت قشر آسیب پذیر (نوزادان، سالخوردگان، افرادی با ضعف سیستم ایمنی) می گردند.
روش شمارش باکتر ی های هتروتروفیک
این آزمایش ، تعداد کل میکروب های موجود در واحد حجم نمونه،را بررسی می کند و به روش پورپلیت معروف است و با آن تمام باکتریهای موجود در یک نمونه آب ،فاضلاب و… را نمی توان شمارش کرد زیرا روش یا محیط کشتی که بتواند کلیه نیازهای فیزیولوژیک باکتری های گوناگون را فراهم آورد وجود ندارد.در این آزمایش روش استاندارد کشت در محیط PCA(پلیت کانت آگار) در شرایط هوازی به مدت 3 روز در دمای 35درجه سانتی گراد به کار می رود.روش مذکور همه میکروبهای را که در این شرایط نمی توانند رشد کنند(مانند بی هوازی اجباری) حذف می نماید.
با یک پی پت استریل 1ml از آب نمونه (آب آشامیدنی ) را وارد یک پی پت استریل کنید. سپس 15CCمحیط کشتPAC که دمای آن 45 درجه سانتی گراد است به آن اضافه کنید و با حرکت چرخشی کاملا یکنواخت مخلوط کنید.منتظر باشید تا محیط ببندد و سپس در دمای 35 درجه سانتی گراد قرار دهید. در صورت نمونه برداری از آب سایر منابع، باید رقت هایی از آب نمونه تهیه نمود، بعد از 48ساعت پلیت هایی را که دارای 30-300کلنی هستند شمارش کنید و تعدا کلنی ها در عکس ضریب رقت ضرب می شود.
کلنی های مورد مطالعه در این روش به صورت دوتایی – زنجیره ای- خوشه ای و یا منفرد می باشند،که همه انواع آن تحت واحد های تشکیل دهنده کلنی CFUنامیده می شوند .شمارش نهایی به مقدار موثر انتشار کلنی بستگی دارد از این رو روش کار و محیط کشت به گونه ای باید انتخاب شود که بتواند بیشترین تعداد کلنی را در مدت معینی از گرماگذاری تولید کند.
